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倒置熒光顯微鏡使用常見(jiàn)問(wèn)題和解決

倒置熒光顯微鏡是細胞培養、細胞轉染和很多生物研究中常用的儀器，相比共聚焦顯微鏡，倒置熒光顯微鏡的成像精度雖然稍低，但儀器更普及，更容易買(mǎi)到或者約到，而且使用維護都更簡(jiǎn)單點(diǎn)。今天我們就給大家分享下倒置熒光顯微鏡使用可能遇到的常見(jiàn)問(wèn)題，以及可能的解決辦法。

·什么是倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡MF52-CF

倒置熒光顯微鏡由倒置顯微鏡和落射熒光模塊組成，倒置顯微鏡是相對正置顯微鏡的概念，其物鏡、照明系統相對樣品的位置是顛倒的；落射熒光模塊是熒光觀(guān)察的核心部件，有轉盤(pán)式熒光模塊和集成熒光模塊兩種，轉盤(pán)式后期可升級，但需要獨立的熒光光源燈箱，用轉盤(pán)式模塊的倒置熒光顯微鏡更大、更重、更貴。

·為什么要用倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡通常最高只會(huì )配40X物鏡，因此放大倍率、分辨率不如正置熒光顯微鏡，但勝在應用層面更方便好用。

倒置熒光顯微鏡觀(guān)察多孔板

首先倒置熒光顯微鏡的物鏡有更長(cháng)工具距離，可以適配各種培養皿從底部直接成像，從而節省了反復制樣做玻片的麻煩，效率更高更適合大批量、多視野培養細胞等樣品的觀(guān)察。

倒置熒光顯微鏡觀(guān)察無(wú)沾染觀(guān)察

另一點(diǎn)優(yōu)勢是倒置熒光顯微鏡可以無(wú)沾染觀(guān)察，無(wú)沾染意思是因為觀(guān)察無(wú)需打開(kāi)培養皿，可避免取樣制樣帶來(lái)的沾染污染風(fēng)險。

倒置熒光顯微MF53-N搭配顯微操作系統

最后一個(gè)倒置熒光顯微鏡的優(yōu)勢是更大的工作空間，因為倒置熒光顯微的明場(chǎng)照明系統采用的是長(cháng)工作距離聚光鏡，因此載物臺上方有更大空間，更方便安裝使用顯微操作系統等配件。

·怎么使用倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡相襯和熒光疊加成像

倒置熒光顯微鏡通?？梢詫?shí)現明場(chǎng)、相襯和熒光觀(guān)察，如果儀器附近有貼SOP或者說(shuō)明書(shū)，可以看看，快速上手。明場(chǎng)觀(guān)察很簡(jiǎn)單，可以看病理切片等樣品，這里不贅述；相襯觀(guān)察需要切換到相襯物鏡，然后把上光源光強調高，聚光鏡光闌調到PHP位置（最大位置），切換相襯環(huán)板到對應的位置即可；難點(diǎn)是熒光觀(guān)察，不同倒置熒光顯微鏡有不同結構，大致可以分為研究級倒置熒光顯微鏡和新型倒置熒光顯微鏡兩種，我們分別以MF53-N和MF52-N為例進(jìn)行說(shuō)明。

研究級倒置熒光顯微鏡MF53-N

MF53-N是研究級倒置熒光顯微鏡的代表，它采用轉盤(pán)式熒光模塊，可以按需選擇不同的熒光激發(fā)塊，背面帶熒光燈箱接口，可以使用大功率寬光譜LED熒光光源MG-100、四通道光源MG-120或者汞燈等作為熒光光源。

這種倒置熒光顯微鏡會(huì )有獨立的光源控制器，首先關(guān)閉明場(chǎng)光源，通過(guò)控制器打開(kāi)熒光光源，調節光強，然后轉盤(pán)選擇熒光通道，放樣品，操作對焦，再切換分光拉桿到相機成像拍照。不同熒光通道需要分別調節光強并拍照，如果是MG-100或者M(jìn)G-120，光源可以即開(kāi)即用，亮度可自由調節，比較方便，而汞燈使用需要預熱、亮度只能靠ND減光鏡控制，操作更復雜，也更容易出各種問(wèn)題。

倒置熒光顯微鏡MF52-N

MF52-N是新型倒置熒光顯微鏡的代表，它采用高度集成的數顯LED熒光模塊，不需要外接熒光燈箱和控制器，能直接在模塊上控制熒光開(kāi)關(guān)、光強設置和通道切換等操作，并提供數據化光強顯示，可以配備3個(gè)熒光通道，滿(mǎn)足BGU等常見(jiàn)的熒光觀(guān)察需要，更易于使用。

新型倒置熒光顯微鏡結構比研究級簡(jiǎn)單，首先關(guān)閉明場(chǎng)光源，打開(kāi)模塊上的光源開(kāi)關(guān)，然后拉桿切換熒光通道并調節光強，放樣品，后續操作和研究級一樣就行。奧林巴斯CKX41、CKX53都可以通過(guò)明美的倒置熒光模塊升級成類(lèi)似的新型倒置熒光顯微鏡。

升級熒光觀(guān)察的DMIL

另外，尼康TS100、徠卡DMIL這兩款無(wú)限遠光學(xué)倒置，也能通過(guò)我們的熒光模塊和熒光光源升級成倒置熒光顯微鏡，但它們都是外掛熒光光源搭配推拉切換熒光通道的設計，用起來(lái)比一般的新型倒置熒光顯微鏡復雜些。

·怎么拍出好的熒光圖片？

高靈敏度相機成像更好

這是很多實(shí)驗操作人員非常關(guān)心的問(wèn)題，首先要說(shuō)明的一點(diǎn)是，倒置熒光顯微鏡的光路結構比正置熒光顯微鏡復雜，光損更大，因此熒光拍照難度比正置高，需要比較高靈敏度的相機，比如MSX11、MC50-S等，尤其一些采用了固定分光設計的倒置熒光顯微鏡。

半復消色差物鏡效果更好

第二個(gè)點(diǎn)是選擇合適的物鏡，落射熒光觀(guān)察中激發(fā)光和發(fā)射光都需要經(jīng)過(guò)物鏡一趟，物鏡熒光通過(guò)率低的話(huà)會(huì )導致光損非常大，一般的相襯物鏡、帶厚度適配環(huán)的物鏡都有較大光損，可以的話(huà)應該選擇半復消色差的相襯物鏡/普通物鏡，它們上面會(huì )有SAPO（Semi-APO）、PL FL、Fluor之類(lèi)標記，如果有APO標記的復消色差的物鏡更好，如果沒(méi)有半復消色差用Plan標記的平場(chǎng)消色差的物鏡也還能湊合。

多色熒光需要分別微調對焦

第三個(gè)點(diǎn)是對焦，不同熒光通道的波長(cháng)不同，焦面會(huì )有一定的偏移，因此不同熒光通道需要分別微調對焦才能獲得更銳利的成像，明美顯微數碼測量分析系統軟件界面下方的清晰度狀態(tài)數據可以為對焦提供參考。如果您是半復消色差的相襯物鏡，還能先在相襯下對好焦，再切換到熒光拍照，減少淬滅的可能性。

·可能遇到哪些常見(jiàn)問(wèn)題？

倒置熒光顯微鏡結構比共聚焦簡(jiǎn)單，出問(wèn)題的機率更低，但并不是不會(huì )出問(wèn)題，好消息是很多問(wèn)題可能簡(jiǎn)單處理一下也能排除。

熒光模塊沒(méi)轉到位會(huì )擋住激發(fā)光

常見(jiàn)問(wèn)題1：沒(méi)有激發(fā)光。從光源開(kāi)始檢查光路，光源接好并打開(kāi)了嗎？熒光切換機構是否旋轉到位/拉桿切換到位了？是否有錯位的ND濾鏡？是否Shutter關(guān)上了？如果整個(gè)光路都正常，可能就是光源壞了，對于汞燈就是換燈泡，LED熒光光源可能換個(gè)通道還能用，因為不同熒光通道對應的是不同的LED燈珠/燈珠陣列。

分光拉桿沒(méi)拉到位會(huì )沒(méi)有成像

常見(jiàn)問(wèn)題2：有激發(fā)光但沒(méi)成像。先觀(guān)察分光欄桿，分光欄桿沒(méi)到位的話(huà)目鏡和相機都會(huì )沒(méi)有成像，目鏡通常很好確認有無(wú)熒光，除非是CY5之類(lèi)肉眼看不見(jiàn)的近紅外波長(cháng)。目鏡有成像，相機看不到就要調整曝光時(shí)間和曝光增益，如果近期升級過(guò)系統可能還有驅動(dòng)失效之類(lèi)問(wèn)題。如果最終成像細節較差、容易過(guò)曝，基本就是相機靈敏度太低的問(wèn)題，除了升級相機沒(méi)有什么好方法解決。

亂動(dòng)燈箱上的旋鈕會(huì )導致熒光不均勻

常見(jiàn)問(wèn)題3：有成像但有異常瑕疵，就要看情況。比如熒光不均勻，可能是熒光燈箱調錯了聚光位置；有強熒光背景，可能是上聚光鏡反光了，上聚光鏡有擋板的用擋板，無(wú)擋板的收小光闌也可能有用；FITC和TRITC重疊、有信號但預期目標沒(méi)染出來(lái)，可能不是儀器問(wèn)題，是出現了交叉反應，需要重新檢查染色流程是不是做錯了。

·倒置熒光顯微鏡能不能用高倍油浸物鏡？

一般來(lái)說(shuō)倒置熒光顯微鏡配備的物鏡最高只有40X，因為倒置熒光顯微鏡的上聚光鏡NA數值孔徑不到0.6，無(wú)法匹配60X/100X等高數值孔徑物鏡。但如果只看熒光觀(guān)察的話(huà)，其實(shí)倒置熒光顯微鏡是可以搭配100X油浸物鏡使用的，需要注意的是，100X物鏡是為0.17厚度的蓋玻片校正的，因此需要使用0.17厚度的共聚焦培養皿或者反轉放置的細胞爬片。

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