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單分子熒光成像：外泌體分泌動(dòng)力學(xué)受溫度控制

熒光顯微鏡的出現，讓細胞器的觀(guān)察成為可能，而如果要觀(guān)察到更細致的目標，則需要做單分子熒光成像，今天我們就來(lái)分享一個(gè)今年用TIRF全內反射熒光顯微鏡做的單分子熒光成像研究：外泌體分泌動(dòng)力學(xué)受溫度控制。

·為什么使用TIRF全內反射熒光顯微鏡

全內反射熒光顯微鏡MF53-TIRF

TIRF全內反射熒光顯微鏡是利用光線(xiàn)全反射后形成衰逝波特性，來(lái)實(shí)現薄區域熒光觀(guān)察的光學(xué)儀器，這種顯微鏡相比常規熒光顯微鏡（寬場(chǎng)熒光），背景熒光顯著(zhù)更低，可以實(shí)現信噪比更高、細節更豐富的熒光成像，尤其適合應用于細胞膜物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀(guān)察。

衰逝波①

衰逝波是一種光學(xué)現象，當激發(fā)光以特定角度入射時(shí)，會(huì )發(fā)生全反射現象，所有激發(fā)光會(huì )被反射，靠近反射面的樣品面則會(huì )形成一個(gè)深度僅幾百納米，光強呈指數衰減的激發(fā)光，稱(chēng)為衰逝波。

普通熒光成像與TIRF成像對比①

 利用衰逝波，TIRF全內反射熒光顯微鏡可以將激發(fā)范圍控制在樣品面極薄的區域，從而避免了傳統熒光顯微鏡焦面以外的熒光激發(fā)形成的模糊光暈，大大提升了信噪比和分辨率。由于衰逝波光強呈指數衰減，因此最合適的應用是細胞膜相關(guān)研究。

·外泌體分泌動(dòng)力學(xué)受溫度控制

我們來(lái)看一個(gè)論文案例，從中了解TIRF全內反射熒光顯微鏡的應用優(yōu)勢：超高分辨率、動(dòng)態(tài)觀(guān)察。

使用CD63-pHluorin可視化pH敏感蛋白

 使用CD63-pHluorin可視化外泌體與質(zhì)膜融合過(guò)程。TIRF全內反射熒光顯微鏡可以實(shí)現單分

子動(dòng)態(tài)跟蹤觀(guān)察，為此需要配備高幀率、高靈敏度的顯微鏡相機，比如MSH12之類(lèi)背照式sCMOS科學(xué)相機。

按成像分析，區分外泌體不同活動(dòng)方式②

 單分子熒光成像研究通常涉及數據統計分析等內容，往往需要一定的算法設計來(lái)自動(dòng)化分析和量化處理，比如本論文使用的就是MATLAB腳本，在github可以下載。

成像分析可靠性驗證，排除溶酶體或囊泡轉運②

通過(guò)成像分析CD63-pHluorin可視化外泌體與質(zhì)膜融合，排除溶酶體或囊泡轉運。

外泌體與質(zhì)膜融合有多種動(dòng)力學(xué)模式②

算法分析，得出外泌體與質(zhì)膜融合有多種動(dòng)力學(xué)模式。

外泌體與質(zhì)膜融合事件受溫度控制②

對不同動(dòng)力學(xué)模式進(jìn)行分析，顯示外泌體與質(zhì)膜融合事件受溫度控制。

模型驗證②

利用模型驗證解釋實(shí)驗觀(guān)察到的動(dòng)力學(xué)。

進(jìn)一步的動(dòng)力學(xué)分析②

外泌體與質(zhì)膜融合前先有對接。

·結尾

總體而言，全內反射熒光顯微鏡MF53-TIRF是細胞表面物質(zhì)動(dòng)態(tài)觀(guān)察的理想儀器，如固定在蓋玻片或細胞膜表面上的分子等，在TIRF基礎上明美還有dSTORM超分辨成像方案，有興趣的老師可以跟我們聯(lián)系。

如您對這篇論文感興趣，或者有興趣獲取論文使用的MATLAB自動(dòng)分析處理腳本，請參考應用來(lái)源部分信息②。

引用來(lái)源：

①Fish KN. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. Curr Protoc. 2022 Aug;2(8):e517. doi: 10.1002/cpz1.517. PMID: 35972209; PMCID: PMC9522316.

②Mahmood A, et al. Exosome secretion kinetics are controlled by temperature. Biophys J. 2023 Apr 4;122(7):1301-1314. doi: 10.1016/j.bpj.2023.02.025. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36814381; PMCID: PMC10111348.