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FISH熒光原位雜交技術(shù)與熒光顯微鏡
熒光原位雜交技術(shù)(FISH)
熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)是臨床病理檢測中廣泛運用的一種分子細胞遺傳學(xué)診斷技術(shù),其原理是用熒光染料直接或間接標記的DNA核酸探針與待測樣本中的DNA核酸序列按照堿基互補配對的原則進(jìn)行雜交,然后通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察熒光信號位置、數量等來(lái)判斷待測序列的缺失、擴增及易位等情況。
FISH熒光原位雜交原理(來(lái)源NIH)
目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于染色體精細結構變異分析、動(dòng)植物基因組結構研究、人類(lèi)產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)、基因組進(jìn)化研究、病毒感染分析等眾多領(lǐng)域。在臨床中應用較多的有以下幾種:
(1)乳腺癌Her-2/neu基因檢測,乳腺癌細胞中Her-2/neu基因的擴增一般預示著(zhù)患者預后較差,應用針對該基因異常擴增的靶向治療藥物,能特異性地控制癌細胞的生長(cháng),改善病人預后。Her-2/neu擴增是靶向藥物使用的關(guān)鍵指標,而檢測Her-2/neu擴增的金標準即為FISH
MC50-S拍攝的兩種Her-2檢測結果(紅多于綠表示擴增,要用藥)
(2)宮頸癌TERC基因檢測,準確區分宮頸細胞高度癌前病變與低度癌前發(fā)育異常,靈敏度和特異性超過(guò)百分之90;
(3)膀胱癌3、9、7、17號染色體數目異常檢測,使用樣本為尿液,屬于無(wú)創(chuàng )性早期診斷;
(4)產(chǎn)前檢測,13、18、21、X、Y染色體數目異常檢測,及時(shí)發(fā)現異常胎兒并判斷染色體疾病種類(lèi);
(5)血液腫瘤檢測,通過(guò)FISH檢測特定基因,可準確預測預后及指導臨床個(gè)性化治療。
FISH技術(shù)本質(zhì)是對遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測,所使用的標本類(lèi)型可以包括1、遺傳?。和庵苎?、羊水、絨毛、胎兒臍帶血,或羊水和絨毛的間期細胞;2、血液?。和庵苎蚬撬璧娜旧w或間期細胞;3、實(shí)體腫瘤(包括骨髓活檢)。理論上講,任何含有足夠癌細胞或DNA的組織、細胞或體液(如胸水、腹水等)標本都可進(jìn)行相應的基因狀態(tài)檢測。
總體而言,FISH可以檢測100kb左右的異常,遠遠高于明場(chǎng)下核型分析的分辨率,同時(shí)由于是原位雜交,可以直接體現異常細胞百分比,對于臨床后期治療有著(zhù)很強的指導作用,且耗時(shí)短,操作簡(jiǎn)單,已逐步成為臨床檢測、預后監測、用藥指導等重要的技術(shù)手段。
FISH熒光原位雜交的成像挑戰
(1)熒光信號點(diǎn)弱,需要大功率熒光光源激發(fā)。由于不適當的包埋、固定或探針本身等因素,需要使用高亮度光源才能對熒光探針進(jìn)行激發(fā)。傳統使用汞燈作為熒光光源,在亮度等方面具有一定的優(yōu)勢,但同時(shí)存在熱損傷、壽命短、需要預熱等待、維護復雜等問(wèn)題,目前已逐步被大功率LED光源所取代。明美系列大功率LED熒光光源克服汞燈的缺點(diǎn),光譜覆蓋大部分探針激發(fā)波段,同時(shí)具有亮度高、低光毒性、低熱損傷、過(guò)萬(wàn)小時(shí)壽命、即開(kāi)即用等特點(diǎn),是FISH檢測中理想的熒光光源。
(2)容易有背景噪聲干擾,需要高截止性能的濾光片組。在使用高亮度熒光光源情況下,使用長(cháng)通濾光片或截止性能差(OD截止深度低)的濾光片,會(huì )導致背景噪聲比正常情況高,而所需要的探針信號會(huì )被淹沒(méi)在噪聲中,從而造成假陽(yáng)性或假陰性結果。明美熒光激發(fā)塊" a="">明美熒光激發(fā)塊">明美熒光激發(fā)塊和研究級熒光顯微鏡使用進(jìn)口濾光片,根據需要可選擇不同窄帶濾光片或雙通濾光片,可有效消除背景熒光干擾,獲得高信噪比的熒光成像。
進(jìn)口CHROMA濾光片,具有高透光率和優(yōu)良的截止性能
(3)不同通道下探針信號疊加的挑戰,包括熒光顯微鏡本身性能及FISH圖像處理軟件功能。
對于熒光顯微鏡需要①具有多熒光通道,例如常規的FISH檢測需要使用DAPI、FITC、TexasRed分別對細胞質(zhì)、蛋白質(zhì)(抗體)、細胞骨架進(jìn)行標記,就要求熒光模塊至少具有三個(gè)通道;②機身穩定及調焦機構的精細程度,FISH檢測通常在100倍物鏡下進(jìn)行,信號點(diǎn)可能在不同的焦面,就需要多次微調焦面以得到全部的信號點(diǎn),高倍下的操作要求顯微鏡具有良好的剛性及精細的調焦行程,以避免圖像漂移和遺漏信號點(diǎn)。
常用的探針熒光染料
對于軟件需要①能對信號點(diǎn)進(jìn)行增強及將背景熒光消除,部分探針信號點(diǎn)亮度較弱,需要通過(guò)軟件對其進(jìn)行增強,以避免被背景熒光覆蓋;②單通道下的圖像疊加,信號點(diǎn)可能位于不同焦面,需獲得多張圖像進(jìn)行疊加合成以得到該通道下目標區域全部的信號點(diǎn);③多通道的圖像疊加,得到的FISH結果是需要對不同探針的位置、數量等情況進(jìn)行統計,需要軟件將不同通道下得到的圖像疊加在一起,需要保證疊加時(shí)不漂移,避免信號點(diǎn)錯位、重疊等造成結果失真。
明美研究級熒光顯微鏡配備6孔落射熒光模塊,可按需配置6個(gè)激發(fā)通道,采用進(jìn)口主機,機身穩定剛性高,針對FISH圖像處理,明美開(kāi)發(fā)了專(zhuān)業(yè)的處理軟件,具有信號增強、背景去除、通道疊加、出具報告等強大功能。
疊加合成圖片
(4)熒光成像要求相機靈敏度高。FISH探針信號往往都是點(diǎn)狀或成簇分布,要求顯微成像相機有較高的靈敏度,同時(shí)具有良好的噪聲控制,這樣才能在背景熒光中獲得所需的點(diǎn)狀/簇狀探針信號。明美MC50-S等熒光顯微相機,像元尺寸超過(guò)3μm*3μm,具有優(yōu)良的弱熒光捕獲能力,同時(shí)具有超低的讀取噪聲,可保證FISH檢測中獲得良好的熒光成像。
(5)FISH高倍檢測下對物鏡成像性能的要求。FISH檢測對象是遺傳物質(zhì)上的信號點(diǎn),通常使用40-100倍物鏡進(jìn)行成像,需要能分辨出點(diǎn)狀或簇狀的探針信號,尤其是在雙通等情況下,成對信號點(diǎn)之間的距離很小,這對于物鏡的分辨率就提出很高的要求。明美MF43-M采用高品質(zhì)半復消色差熒光物鏡,具有高透光率與高數值孔徑,成像效果好,分辨率高。
明美方案
(1)完整FISH熒光原位雜交成像,配套FISH分析系統方案
推薦:熒光顯微鏡MF43-M(醫療器械型號)+顯微相機MC50-S/MS23+熒光光源MG-100/MG-120/MG-200
? 配備6孔落射熒光模塊與大功率LED熒光光源,使用方便激發(fā)效果好
? 高品質(zhì)Chroma濾光片,截止深度大,信噪比高,參數可按需配置
? 高性能主機架,熒光透過(guò)率高,低雜散光,機身穩定,調焦準確順滑
? 高數值孔徑半復消色差熒光物鏡,熒光信號強,成像清晰
? 高靈敏度與低讀取噪聲熒光顯微相機,弱熒光成像效果好
? 獲醫療器械注冊的專(zhuān)業(yè)FISH圖像分析處理軟件,使用方便,功能強大
(2)已有尼康,蔡司,奧林巴斯,徠卡無(wú)限遠顯微鏡,升級FISH分析系統
推薦:尼康,蔡司,奧林巴斯,徠卡無(wú)限遠顯微鏡 + 明美六孔熒光模塊 + 熒光光源MG-100/MG-120/MG-200 +顯微相機MC50-S/MS23
? 適合尼康,蔡司,奧林巴斯,徠卡無(wú)限遠光學(xué)顯微鏡升級
? 專(zhuān)業(yè)六孔熒光模塊,激發(fā)塊可按需選擇,擴展性強
? 方便易用,超長(cháng)壽命的LED熒光光源
? 高靈敏度的FISH專(zhuān)用顯微鏡相機,搭配專(zhuān)業(yè)FISH圖像分析處理軟件
(3)已有尼康,蔡司,奧林巴斯,徠卡熒光顯微鏡,升級LED熒光光源
推薦:MG-100/MG-120/MG-200
? 可匹配尼康,蔡司,奧林巴斯,徠卡主流熒光顯微鏡
? 覆蓋熒光激發(fā)光譜,亮度高,激發(fā)效果穩定
? 觸屏控制器,操作直觀(guān)簡(jiǎn)單
? 壽命長(cháng),即開(kāi)即用,維護簡(jiǎn)單
? MG-200液冷散熱,提供更接近汞燈的光強,尤其加強G波段
明美是國家高新技術(shù)企業(yè),創(chuàng )立至今已20年,專(zhuān)注于顯微鏡以及顯微成像系統產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和銷(xiāo)售,致力于顯微成像領(lǐng)域的自動(dòng)化、數字化、智能化;明美迄今已為全球10萬(wàn)+的用戶(hù)提供過(guò)產(chǎn)品以及服務(wù);明美曾屢獲國家創(chuàng )新基金支持,被廣東省科技廳認定為顯微成像工程技術(shù)研究中心。
公司以品質(zhì)謀發(fā)展,以服務(wù)為宗旨,連續11年獲守合同重信用企業(yè)認證,已通過(guò)ISO9001質(zhì)量管理體系、ISO14001環(huán)境管理體系、ISO13485醫療器械質(zhì)量管理體系和知識產(chǎn)權管理體系認證,擁有二類(lèi)醫療器械生產(chǎn)資質(zhì)。
明美總部位于廣州,在全國20余個(gè)大中城市均設有服務(wù)網(wǎng)點(diǎn),提供完善的專(zhuān)業(yè)服務(wù)。
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